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EMSA/凝膠轉移測定

更新時間:2023-08-29      點擊次數:295

EMSA(電泳遷移率變動測定)用于研究蛋白質:DNA 復合物和相互作用。蛋白質:DNA 復合物在非變性凝膠上比未結合的線性 DNA 遷移得更慢,從而導致“移位"。

EMSA 也稱為“凝膠位移"或“凝膠阻滯"測定,可用于分析蛋白質對核酸的序列特異性識別。

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圖 1. EMSA/凝膠位移測定圖。當添加摩爾過量的未標記競爭DNA時,遷移率變化會大大降低。熒光標記的 IRDye 700 寡核苷酸探針用于檢測。 IRDye 700 寡核苷酸在兩條鏈上均進行末端標記。



近紅外熒光的優點

近紅外熒光 EMSA 為放射性 EMSA 技術提供了安全、靈敏的替代方案。

您可以輕松地將傳統的放射性 EMSA 協議應用于無害的近紅外熒光 EMSA 檢測。使用 IRDye ®末端標記的寡核苷酸并使用 Odyssey ® CLx 紅外成像儀或 Odyssey 經典紅外成像儀進行成像。使用近紅外熒光,您可以在不到 2 小時內進行測定并獲得結果,而使用其他方法則需要幾個小時或過夜。






使用近紅外熒光技術的 EMSA 用于研究:

  • 轉錄調控

  • DNA復制

  • DNA修復

  • RNA加工

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圖 2.EMSA/凝膠位移測定。 IRDye 700 EMSA 使用共有寡核苷酸針對 3 個不同的轉錄因子靶點進行測試。箭頭表示移動性轉變的位置。



您可以檢測濕凝膠中的蛋白質:DNA 復合物,無需凝膠干燥或膠片曝光。如果需要,您可以在 Odyssey 掃描儀表面上對盒中的凝膠進行成像,以評估凝膠是否運行了足夠長的時間,如果沒有,請將其放回腔室中以進一步進行電泳。

即用型標記寡核苷酸 可用于各種常見的共有序列。其他 IRDye 末端標記寡核苷酸和定制寡核苷酸可通過Integrated DNA Technologies (IDT)、TriLink BioTechnologiesMetabion International AG 獲得。

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圖 3. 使用 IRDye 700 AP-1 寡核苷酸雙鏈體的 AP-1 EMSA。用血清處理的 HeLa 細胞的核提取物用于觀察血清刺激后 AP-1 結合增加的情況。競爭反應含有 100 倍摩爾過量的未標記寡聚雙鏈體。箭頭表示熒光寡核苷酸的遷移率變化。星號表示由于過量未標記的競爭對手 DNA 引起的遷移率變化的減少。使用 Odyssey Classic 紅外成像儀對濕凝膠進行成像。


紅外熒光EMSA與其他方法的比較

比較 EMSA 檢測方法,了解如何使用紅外檢測提高安全性并節省時間。

IRDye ®紅外熒光染料放射性同位素生物素/鏈霉親和素(例如 Thermo Scientific LightShift)
總時間: 1.5小時總時間: 4.5 – 24 小時總時間: 4.5 – 5 小時
輕松獲取和處置監管限制、處置麻煩和成本聯系制造商了解詳情
熒光寡核苷酸具有更長的穩定性標記寡核苷酸的半衰期短化學發光信號不穩定
無危險危險的聯系制造商了解詳情
濕凝膠成像,無需移除凝膠板需要凝膠干燥和膠片/熒光屏曝光需要進行膜轉移
快速、方便、直接檢測耗時、檢測不方便間接檢測方法。需要封閉、鏈霉親和素孵育和洗滌
如果需要,可以更換凝膠并延長運行時間凝膠運行時間無法延長凝膠運行時間無法延長
不到 2 小時即可得出結果通常要到第二天才能獲得結果檢測步驟使協議增加了幾個小時



典型 EMSA 工作流程


準備反應并孵育20-30日分鐘

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通過非變性電泳分離


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使用 Odyssey Imager 進行圖像凝膠并分析

*如果需要,請重復步驟 3 并再次成像。

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