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點擊化學的應用——測定細胞增殖和 DNA 復制

更新時間:2023-08-30      點擊次數:264

細胞增殖測定廣泛應用于細胞毒性研究、癌癥研究和細胞生物學的許多其他領域。其中許多可以通過熒光標記對增殖細胞進行可視化,并且適合高通量篩選。

檢測復制的 DNA 可以說是檢測增殖的最直接方法。這是通過使用溴脫氧尿苷 (BrdU)核苷實現的,該核苷在復制過程中融入 DNA。然后,細胞 DNA 中的這些核苷修飾可以通過抗 BrdU 抗體檢測到。盡管具有特異性,但這種測定方法繁瑣且難以重現,因為需要用刺激性試劑處理細胞,以使 DNA 暴露于抗體,否則這些抗體不會穿透細胞結構。

一種更溫和的替代方案是乙炔基脫氧尿苷 (EdU),可以通過將其添加到培養基中或注射到動物體內來將其遞送至細胞。摻入 DNA 后,該核苷可在銅 (I) 催化下與各種熒光染料疊氮化物結合,從而對復制的 DNA 進行熒光染色。該測定易于執行、快速且可重復。它不需要對細胞進行嚴酷的處理(只需要用 Triton 進行透化),因此可以更好地保存細胞結構。在用疊氮化染料處理和最后的洗滌步驟(步驟 8)后,可以使用具有各種發射波長的熒光團(例如 Hoechst、DAPI 或熒光標記抗體)來標記細胞。

所需試劑

  1. 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷 (EdU)

  2. Cu-TBTA 絡合物— сlick сhemistry 催化劑

  3. 抗壞血酸— 銅的還原劑

  4. 疊氮化物熒光染料

  5. DMSO,標簽級— 疊氮化物溶劑

  6. Triton X-100(或 Tween-20)

  7. PBS,pH 7.4

  8. 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4

確切的方案取決于特定的細胞或組織類型,但一般工作流程如下所述:

  1. 將細胞/組織與 10–20 μM EdU 孵育所需的時間。

  2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定細胞 15 分鐘。

  3. 用 PBS 清洗細胞。

  4. 用含有 0.2% Triton X-100(或 0.5% Tween-20)的 PBS 透化細胞 30 分鐘。

  5. 再次用 PBS 清洗細胞。

  6. 在 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4(對于磺化疊氮化物)或 100 mM Tris 緩沖液,pH 7.4,含有 50% DMSO(對于非-磺化疊氮化物)。該混合物應新鮮制備,因為銅 (I) 在水溶液中不穩定。

  7. 將細胞與點擊反應混合物一起孵育 30 分鐘。

  8. 用 PBS 清洗細胞。

  9. (可選)如果細胞必須用不同的熒光團標記,請使用標準方案繼續染色。

磺化(水溶性)疊氮化物,例如磺基氰疊氮化物和 AF 疊氮化物,可產生最佳效果。當使用非磺化疊氮化物(例如氰疊氮化物或 BDP 疊氮化物)時,確保反應混合物中 DMSO 濃度為 50%。


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