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CLiM™技術——CLiM™親和標簽系統簡介

更新時間:2023-12-27      點擊次數:49

CLiM™親和標簽系統

CLiM  親和標簽系統基于兩種小蛋白質之間形成的超高親和力復合物。 CL7 (16 kDa) 是與靶蛋白融合的標簽,lm7 (10 KDa) 是與瓊脂糖樹脂偶聯的配體。 

CL7 的 WT 版本是 CE7 DNase,一種有毒細菌蛋白。工程突變消除了其 DNA 結合和 DNAse 活性,同時保留了與 lm7 的超高親和力。

成分 

CL7標簽

CL7 標簽可以表達在目標蛋白的 N 或 C 末端。我們的質粒提供溶解度標簽、親和標簽和切割位點的組合以及多種克隆選項。

在對照實驗中,CL7 對溶解度或表達沒有表現出負面影響。事實上,當在沒有標簽的大腸桿菌中表達時,CL7 提高了原本不溶的蛋白質的表達水平和溶解度。當用 CL7 標簽表達時,一些臨床和治療相關的蛋白質從不溶性部分轉移到可溶性部分。純化可溶表達的蛋白質不需要變性劑或包涵體重折疊。這些蛋白質在基于細胞的測定中表現出與其他商業/臨床樣品相同的生物活性。

 

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Im7樹脂

lm7 樹脂由固定在瓊脂糖樹脂上的 CL7 結合伴侶 lm7 組成。 lm7 和 CL7 之間的高度特異性親和力導致樹脂脫靶最小化。 35-40 mg/mL 的高樹脂結合能力可以捕獲大量 CL7 標記的蛋白質。 lm7 結構域具有高度彈性:使用 Gdn-HCI,樹脂可以再生并重復使用多達 100 次。

洗脫蛋白酶

蛋白酶對于從 lm7 樹脂柱上洗脫目標蛋白至關重要。 TriAltus 生產自己的高活性、超高親和力純度的 SUMO 和 PSC 蛋白酶。這兩種 TriAltus 蛋白酶的裂解速度比競爭對手的產品更快,而且成本更低。 

例如,如果 60-80 mg 蛋白質與 5 mL 柱結合,則 1 mg 蛋白酶溶于 20 mL 洗脫緩沖液中,流速為 0.2 mL/min,只需 1.5-2 小時即可洗脫蛋白質。少量的蛋白酶太稀了,可能不需要去除。如果需要,可以使用用于 SUMO 的鎳柱和用于 PSC 的谷胱甘肽來執行拋光步驟。 

SUMO 

SUMO 蛋白酶用于洗脫 N 末端標記蛋白。這種高度特異性的酶可識別 SUMO 結構域的三級結構并切割其 C 端,切割后不留下任何氨基酸殘基。其特異性使其切割速度比 PSC 更快。 4°C 下, 1  μg SUMO 在 30 分鐘內將 2 mg 底物裂解 96%,在 40 分鐘內裂解 99%。

PSC 

PSC 蛋白酶用于切割 N 或 C 末端標記的蛋白質。它也非常高效:在 4 °C 下,20 μg PSC 將在 40 分鐘內以 91% 的速度裂解 2 mg 底物,在 60 分鐘內以 99% 的速度裂解 。

一步層析純化方案 

CL7 和 Im7 的鹽獨立性和高度特異性的結合親和力可實現簡單且簡化的實驗方案。 CL7 不是使用 His-trap 作為第一步,然后使用特殊標簽來精煉蛋白質,而是通過一個色譜步驟即可實現超高純度。

優點

蛋白質純化系統根據其在兩個參數下的性能進行評估:產量和純度。  CLiM™  親和標簽系統在兩個賬戶上的表現都優于 His 標簽和特殊標簽。 

 

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屈服

TriAltus 的高結合能力樹脂的高效偶聯方法遠遠優于其他專用標簽的樹脂。 lm7 6B 樹脂的結合能力在 35-40 mg/mL 范圍內,4B 樹脂的結合能力 >60 mg/mL。 

純度

蛋白質純化系統可達到的純度取決于其對未標記細胞成分的敏感性。雜質類型包括基于標記靶蛋白/細胞成分相互作用的雜質以及由于未標記細胞成分與柱結合配體的非特異性結合而產生的雜質。 

與靶蛋白的相互作用

在高鹽濃度緩沖液存在的情況下,CL7 與 Im7 的結合不受干擾。高鹽緩沖液可在純化過程的早期去除雜質,以獲得潔凈的最終產品。特殊標簽對約 0.2-0.3 M 的鹽濃度敏感,導致第一個色譜步驟后純度較低。

非特異性結合

CL7 和 Im7 彼此具有高度的特異性。這可以防止標簽或配體與細胞成分(例如 DNA 和其他蛋白質)之間的非特異性相互作用。 IMAC 系統容易與樹脂中的金屬離子發生非特異性結合。

高耐鹽性和高特異性結合的結合導致了如此高的純度,以至于 CL7/lm7 系統僅需要一個色譜步驟。

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純化的具有挑戰性的蛋白質

多亞基RNA聚合酶-ttRNAP

ttRNAP(嗜熱菌RNA 聚合酶)是一種約 400 kDa 的大蛋白,具有 5 個亞基 ( α ββ'ω) 和 4 個結合位點。傳統上,純化需要五個連續的層析步驟才能獲得足夠高的純度以實現高活性。蛋白質純度與其活性直接相關。將細胞裂解物裝入 1.5 M 鹽緩沖液中是一步純度的關鍵。 CL7 標簽僅附著在最大的 β' 亞基上, 不會干擾亞基組裝。 

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DNA/RNA 結合蛋白 - Cas9

Cas9是CRISPR技術的重要組成部分。 Cas9 活性與其純度直接相關,但通常需要 4-5 個色譜步驟才能達到所需的純度。 Cas9 帶有 CL7 標簽并加載在 1.5 M 鹽緩沖液中,一步純化即可達到 99% 的純度。該酶在細胞檢測和 體外 檢測中均顯示出高活性。 

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膜蛋白-YidC

YidC 是一種~32 kDa 細菌膜整合酶。膜蛋白很難純化,因為與細胞成分的疏水接觸會造成污染。由于組氨酸標簽非特異性地結合到其柱上,因此在一步純化后會出現大量雜質。 CL7 對 Im7 的特異性最大限度地減少了這些影響,使純度高達 99%。

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折疊不良的治療蛋白 - GCSF、hGH 和 IFN- α

FDA 批準的三種生物制劑——GCSF、hGH 和 IFN-α——各自具有兩個內部半胱氨酸橋,在沒有標簽的大腸桿菌中表達時通常不溶。純化不溶性蛋白質通常涉及棘手的重折疊步驟,然后是多個色譜步驟。 CL7 增強蛋白質的表達、穩定性和折疊,使它們不再以包涵體形式表達。這些蛋白質表現出與基于細胞的陣列中的其他商業/臨床樣品相當的生物活性。 

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